Kỹ thuật đông lạnh và rã đông tinh trùng

1. Tổng quan
Đông lạnh tinh trùng là một kỹ thuật mang lại nhiều lợi ích cho điều trị vô sinh cũng như bảo tồn khả năng sinh sản của nam giới. Đông lạnh tinh trùng thường được chỉ định cho các trường hợp sau: tích lũy tinh trùng khi số lượng tinh trùng tươi không đủ cho 1 chu kỳ điều trị, bệnh nhân khó lấy mẫu, chồng không có mặt ngày vợ chọc hút, đông lạnh để bảo tồn khả năng sinh sản trước khi điều trị ung thư, ngân hàng tinh trùng. Hiện nay, đông lạnh và rã đông tinh trùng đã trở thành một quy trình thường quy tại các đơn vị hỗ trợ sinh sản (HTSS). Nguyên tắc của đông lạnh là đưa tế bào về ngưỡng nhiệt độ rất thấp (-196ºC), tại đó, các phản ứng sinh hóa và hoạt động trao đổi chất của tế bào hầu như đều bị dừng lại, tế bào sống ở dạng tiềm sinh (Hồ Mạnh Tường, Nguyễn Thị Mai; 2000). Khi cần sử dụng, tinh trùng sẽ được rã đông và qua các bước xử lý chuyên biệt nhằm thu nhận tinh trùng sử dụng cho IVF (In-vitro Fertilization). Tại Việt Nam, tỷ lệ di động sau rã đông đối với tinh trùng thu nhận từ các mẫu mô tinh hoàn ở bệnh nhân vô tinh do tắc đạt 30% và tỷ lệ có thai khi thực hiện IVF với tinh trùng này là 28% (Trương Thị Thanh Bình và cs., 2009).

Trong quá trình đông lạnh và rã đông, tinh trùng có thể bị tổn thương do tác động của nhiệt độ. Do đó, những chất bảo quản lạnh (CPA) như glycerol, DMSO, EG hay PROH được thêm vào môi trường đông lạnh nhằm hạn chế những tác động xấu đến chất lượng tinh trùng sau rã đông. Một quy trình đông lạnh tinh trùng thường diễn ra theo 3 bước chính theo thứ tự: (1) cho tinh dịch tiếp xúc với môi trường chứa chất bảo quản lạnh, (2) hạ nhiệt độ, (3) lưu trữ trong ni-tơ lỏng. Hiện nay, có 2 phương pháp đông lạnh chính được sử dụng để đông lạnh tế bào nói chung và tinh trùng nói riêng là: đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm và thủy tinh hóa.

2. Đông lạnh tinh trùng bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm
Đông lạnh tinh trùng bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm (Slow freezing) hay còn gọi là hạ nhiệt theo chương trình là kỹ thuật đông lạnh được sử dụng phổ biến hiện nay ở các trung tâm IVF. Nguyên tắc của quá trình hạ nhiệt độ chậm là dần dần đưa tinh trùng về nhiệt độ rất thấp (-196ºC) theo từng ngưỡng nhiệt độ khác nhau. Trước khi đông lạnh, mẫu trữ sẽ được tiếp xúc với chất bảo quản lạnh (cryoprotective agents – CPA), thông thường là glycerol 5-10% theo tỷ lệ 1:1. CPA được bổ sung vào mẫu trữ tinh trùng theo nồng độ tăng dần, tốc độ xâm nhập thấp và theo từng giai đoạn để giảm thiểu sốc thẩm thấu cho tinh trùng. Bên cạnh đó, nồng độ CPA thấp cũng hạn chế gây độc cho tinh trùng.

Trong kỹ thuật này, nước ngoại bào đóng băng thành các tinh thể băng và tạo ra hai pha: tinh thể băng của nước tinh khiết và một phần không đóng băng chứa nước, muối, đường và CPA. Lúc này, sự thay đổi về nhiệt độ sẽ làm thay đổi tính chất của màng tinh trùng, các chất béo trong màng sẽ trải qua một giai đoạn chuyển từ trạng thái lỏng sang dạng gel, có thể làm hỏng màng tinh trùng (Hammerstedt và cs., 1990). Ngoài ra, trong quá trình trao đổi nước, nước di chuyển ra ngoài tế bào và tạo thành tinh thể đá, làm tăng độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh, cũng có thể làm hỏng cấu trúc tế bào của tinh trùng. Ngưỡng nhiệt độ và thời gian làm lạnh cũng rất quan trọng trong quá trình đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm. Đông lạnh ở nhiệt độ và thời gian thích hợp sẽ làm giảm tổn thương của tinh trùng do biến đổi về nhiệt và hình thành tinh thể đá nội bào, từ đó có thể tăng tỷ lệ sống của tinh trùng sau rã đông. Đối với kỹ thuật đông lạnh tinh trùng bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm, hiện nay có 3 xu hướng là sử dụng máy hạ nhiệt độ theo chương trình tự động, sử dụng tủ âm sâu và không sử dụng máy (đông lạnh chậm cải tiến).

Đông lạnh tinh trùng bằng máy hạ nhiệt độ theo chương trình tự động
Đây là phương pháp đông lạnh truyền thống, được sử dụng phổ biến nhất. Trong phương pháp này, mẫu tinh trùng đã xử lý với CPA được đặt vào trong khay chứa mẫu đã có sẵn ni-tơ lỏng. Trong quá trình hoạt động, ni-tơ lỏng sẽ được bơm vào máy dưới sự kiểm soát của cảm biến nhiệt để đảm bảo chính xác tốc độ và nhiệt độ đã cài đặt. Tương ứng với mỗi khoảng nhiệt độ khác nhau, tốc độ hạ nhiệt cũng thay đổi. Thông thường, từ 25ºC đến -7ºC, nhiệt độ hạ 3ºC/phút; từ -7ºC đến -50ºC, nhiệt độ hạ 0,3ºC/phút; từ -50ºC đến -150ºC, nhiệt độ hạ 30ºC/phút và sau đó đưa thẳng vào ni-tơ lỏng (-196ºC) (WHO 2010).

Đối với phương pháp này, quá trình đông lạnh được kiểm soát tự động, đồng bộ theo chương trình đã cài đặt sẵn, do đó hạn chế được sự tổn thương của tế bào, cũng như các mẫu đều được đông lạnh dưới điều kiện giống nhau. Tuy nhiên, hệ thống đông lạnh cần chi phí đầu tư ban đầu về máy móc lớn (từ 10.000 đến 30.000 USD), cần bảo dưỡng định kỳ và chi phí hao mòn, sửa chữa thiết bị cao.

Đông lạnh tinh trùng bằng tủ âm sâu
Đây là phương pháp sử dụng các hệ thống tủ đông có nhiệt độ rất thấp, từ -20ºC đến -80ºC để đông lạnh tinh trùng. Mẫu sau khi tiếp xúc CPA sẽ được đặt vào tủ -20ºC trong vòng 30 phút, sau đó chuyển nhanh vào tủ -80ºC trong 30 phút rồi nhúng trực tiếp vào ni-tơ lỏng.

Phương pháp này tương đối đơn giản, dễ thực hiện và ngưỡng nhiệt độ làm lạnh được xác định chính xác. Tuy nhiên, các hệ thống tủ trang bị đắt tiền, cần bảo dưỡng cũng như chi phí xử lý sự cố cao. Bên cạnh đó, phương pháp này chỉ sử dụng 2 ngưỡng nhiệt độ là -20ºC và -80ºC nên có thể gây sốc nhiệt cho tinh trùng do thay đổi nhiệt độ nhanh.

Đông lạnh tinh trùng không sử dụng máy (đông lạnh chậm cải tiến)
Phương pháp này sử dụng hơi ni-tơ lỏng để làm lạnh lọ trữ mẫu tinh dịch trước khi đưa vào nhiệt độ -196ºC. Đầu tiên, ni-tơ lỏng được cho vào khay xốp đông lạnh mẫu (dài 80cm x rộng 28,5cm x cao 27cm) ở vạch 3cm tính từ đáy thùng xốp trước khi thao tác để hơi ni-tơ được ổn định. Mẫu tinh dịch được cho tiếp xúc với CPA, sau đó cho vào lọ trữ và để ổn định ở nhiệt độ phòng trên can nhôm. Sau 15 phút, lấy can nhôm gác lên thùng ni-tơ lỏng tại vị trí đã đánh dấu trước. Như vậy, hơi ni-tơ thăng hoa dần làm lạnh lọ trữ có chứa tinh dịch. Mẫu sau khi được làm lạnh đến -50ºC hoặc -80ºC sẽ được nhúng trực tiếp vào ni-tơ lỏng để bảo quản lâu dài.

Phương pháp này không đòi hỏi các thiết bị chuyên dụng và có thể đem lại tỷ lệ tinh trùng sống sau rã đông chấp nhận được. Tuy nhiên, nhược điểm là tốc độ làm lạnh không đồng nhất giữa bên trong và bên ngoài mẫu, giữa các mẫu trữ với nhau, và những khó khăn trong việc duy trì điều kiện giống nhau giữa các lần đông lạnh. Tại Việt Nam, quy trình đông lạnh tinh trùng bằng hơi ni-tơ lỏng đơn thuần đã được xây dựng và cho thấy có hiệu quả tương đương với việc sử dụng máy cho các mẫu tinh trùng có chất lượng tốt cũng như mẫu tinh trùng ít, yếu và dị dạng (Nguyễn Hữu Duy và cs., 2009). Bên cạnh đó, việc sử dụng hơi ni-tơ lỏng đơn thuần cũng giúp giảm chi phí đầu tư, chi phí vận hành cho một chu kì đông lạnh và rã đông tinh trùng.

3. Đông lạnh tinh trùng bằng phương pháp thủy tinh hóa
Về mặt vật lý, thủy tinh hóa được định nghĩa là một quá trình hóa rắn dung dịch với tốc độ làm lạnh cực nhanh làm tăng rất nhanh độ nhớt để dung dịch đạt đến trạng thái ổn định. Phương pháp này giúp loại bỏ sự hình thành tinh thể đá trong hệ thống sinh học. Khi thực hiện hạ nhiệt độ với tốc độ cao thì dung dịch nước muối đẳng trương vẫn có thể được đông lạnh mà không cần CPA. Điều này giúp loại bỏ tất cả các thách thức về sốc thẩm thấu khi sử dụng CPA nồng độ cao. Tuy có vẻ dễ thực hiện nhưng thực tế gặp rất nhiều khó khăn để có thể hạ nhiệt độ mẫu đủ nhanh để xảy ra quá trình thủy tinh hóa.

Để chuẩn bị cho quá trình thủy tinh hóa, một lượng lớn CPA được sử dụng trong môi trường đông lạnh (30-50%) và lượng mẫu khá nhỏ. Tuy nhiên, tinh trùng là tế bào dễ tổn thương trong môi trường có nồng độ CPA cao và vì lý do này, có nhiều ý kiến cho rằng phương pháp thủy tinh hóa không được coi là một phương pháp có thể bảo tồn chất lượng tinh trùng. Trường hợp đông lạnh tinh trùng bằng phương pháp thủy tinh hóa với thể tích nhỏ (20µl) được báo cáo thành công lần đầu tiên vào năm 2002. Kết quả nghiên cứu cho thấy tinh trùng vẫn có khả năng thụ tinh sau khi rã đông (Nawroth F và cs., 2002). Tuy nhiên, vẫn còn một số nguy cơ tồn tại như khả năng lây truyền tác nhân lây nhiễm khi cho mẫu tinh dịch tiếp xúc trực tiếp với ni-tơ lỏng, khó khăn trong quá trình điều trị khi sử dụng các mẫu trữ với thể tích nhỏ, có thể không đủ cho chu kỳ hỗ trợ sinh sản. Bên cạnh đó nhiều nghiên cứu cho rằng, nồng độ CPA cao có thể gây tổn thương độc tính cho tế bào. Vì vậy, nhiều nghiên cứu đã và đang được thực hiện để tìm hướng đi mới cho phương pháp thủy tinh hóa.

Theo nhiều nghiên cứu khác nhau, hình dạng và kích thước của đầu tinh trùng là yếu tố quyết định tính nhạy cảm của chúng đối với môi trường đông lạnh. Theo nhóm tác giả Isachenko và cộng sự, nếu không sử dụng CPA thì việc thủy tinh hóa tinh trùng người vẫn có khả năng thành công (Isachenko và cs., 2007). Tuy nhiên, người ta cho rằng nhược điểm của phương pháp này là giới hạn thể tích mẫu trữ trong một lần trữ. Cũng vào năm 2007, nhóm tác giả Aizpurua và cộng sự đã tiến hành so sánh kỹ thuật trữ tinh trùng bằng phương pháp thủy tinh hóa không sử dụng CPA so với phương pháp hạ nhiệt độ chậm. Kết quả cho thấy tinh trùng trữ bằng phương pháp thủy tinh hóa có độ di động, tỷ lệ sống, cấu trúc DNA nguyên vẹn cao hơn so với mẫu trữ bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm. Do đó, kĩ thuật này dần dần trở thành phương pháp thay thế hiệu quả cho phương pháp hạ nhiệt độ chậm và sẽ phát triển hơn trong tương lai.

4. Rã đông tinh trùng
Rã đông tinh trùng là quá trình đưa tinh trùng từ nhiệt độ -196⁰C về lại nhiệt độ phòng. Quá trình rã đông có mối liên hệ chặt chẽ với quá trình đông lạnh và sự tổn thương tinh trùng không chỉ xảy ra ở quá trình đông lạnh mà còn ở cả quá trình rã đông. Trong quá trình rã đông, các tinh thể đá tan ra có thể gây ảnh hưởng đến những bào quan bên trong tinh trùng. Quá trình rã đông không nên kéo dài quá lâu để tránh hiện tượng tái kết tinh hóa và cũng không nên quá nhanh để nước có thể kịp vào lại bên trong tế bào để việc trao đổi CPA và nước diễn ra từng bước. Những mẫu tinh dịch có chất lượng tốt sẽ có khả năng thích ứng với quá trình đông lạnh – rã đông tốt hơn so với những mẫu có chất lượng yếu. Cần đảm bảo mẫu tinh dịch sau khi rã đông đã hóa lỏng hoàn toàn mới tiến hành những kỹ thuật tiếp theo. Thông thường, mẫu tinh trùng đông lạnh sẽ được để ở nhiệt độ phòng khoảng 15 – 20 phút để rã đông hoàn toàn trước khi lọc rửa hoặc sử dụng.

5. Kết luận
Đông lạnh tinh trùng là một kỹ thuật phổ biến ở các trung tâm hỗ trợ sinh sản. Phương pháp này giúp lưu giữ tinh trùng trong khoảng thời gian dài để sử dụng cho các mục đích khác nhau trong IVF. Trong quá trình đông lạnh, để hạn chế tác động xấu của nhiệt độ đến chất lượng tinh trùng đông lạnh, người ta thường bổ sung các chất bảo quản lạnh (CPA) vào môi trường đông lạnh. Hiện nay, có 2 phương pháp đang được sử dụng phổ biến là hạ nhiệt độ chậm và thủy tinh hóa.

Tài liệu tham khảo
1.     Hồ Mạnh Tường, Nguyễn Thị Mai, L.V.T., (2000). Trữ lạnh tinh trùng trong thụ tinh nhân tạo. Thời sự Y dược học, 5, pp.8-13
2.    Nguyễn Hữu Duy, Trương Thị Thanh Bình, H.T.Q., (2009). So sánh hiệu quả của 2 phương pháp đông lạnh thủ công và dùng máy. NXB Khoa học và Kĩ thuật, Tuyển tập, pp.518-524.
3.    Aizpurua, J. et al., (2017). New permeable cryoprotectant-free vitrification method for native human sperm. Human Reproduction, 32(10), pp.2007- 2015.
4.    Hammerstedt RH et al. Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. J Androl. 1990;11(1):73-88
5.    Isachenko, V. et al., (2004). Cryoprotectant-Free Cryopreservation of Human Spermatozoa by Vitrification and Freezing in Vapor: Effect on Motility, DNA Integrity, and Fertilization Ability. Biology of Reproduction, 71(4), pp.1167-1173